Bigger and Better Photons: The Road to Great FLIM Results
原文链接 by Wolfgang Becker
翻译 by 谭瓅
摘要：这篇文章试图帮助bh FLIM技术的现有和未来用户从FLIM实验中获得最佳结果。第一部分解释了TCSPC FLIM的原理，并给出了记录的光子分布的效果。它表明，测量寿命的信噪比在优先取决于记录的光子数量。第二部分重点介绍优化光子数，而不增加施加到样品中的光应力。我们讨论了激发功率、采集时间、采集效率、数值孔径、聚焦精度、对准精度和探测器效率的影响。第三部分将重点介绍光子效率。它考虑了TCSPC计时参数、计数背景、像素数、仪器响应函数的影响，以及多指数衰减函数的挑战。最后一部分专门介绍数据分析。本文中的所有结论均通过在实际条件下记录的真实测量数据进行演示。
第三部分：最大化光子效率
如“信噪比”小节中所述，TCSPC系统能够达到SNR = SQRT（N）的理论信噪比。然而，这要求探测到的每个荧光光子都会向结果贡献其最大的信息量。这要求正确配置TCSPC计时（timing）参数，避免记录背景光子，并以足够高的精度确定光子时间，这一部分将讨论这些要点。
观测时间间隔
观测时间间隔可以对寿命的信噪比产生影响。图 16 显示了一个示例，采集相同样品的两张图像，采用相同的计数速率和相同的采集时间，激光重复率为50 MHz。在5 ns的观测时间间隔内记录了左侧图像，寿命约为2.2 ns，荧光在观测时间间隔内不会完全衰减，见图16，第二行左。结果，衰减函数尾部的光子没有被记录下来，数据分析过程只能从记录的部分衰减确定寿命。因此，像素上寿命的分布比理想条件下更宽，参见图16，左下角。图 16 中所示的情况非常常见，较短的观测时间间隔非常适用于寿命极短的样品，然而，它们也可能无意中被用于较长的使用寿命，从而获得欠佳的光子效率。
右侧的图像是在12 ns的观测时间间隔内记录的，几乎所有的光子的衰减函数都被记录下来，数据分析可用整个衰减函数来确定寿命，见图16的第二行右。因此，寿命的分布（图16，右下角）比左图窄。
图16：在5 ns（左）和12 ns（右）的观测时间间隔内记录的图像。衰减曲线和直方图显示在第二行和第三行。
此外，衰减曲线在观测时间间隔中的位置也会对光子效率产生影响。图 17 显示了一个示例。对于左侧图像，衰减曲线未正确放置在观测时间窗口中，曲线向右移动，因此衰减曲线的远端不会被记录。图 17（左）中参数设置中的错误可能看起来微不足道且易于纠正 （参考文献[2]），但在TCSPC FLIM数据中经常遇到这种情况。
在右侧的图像中，衰减数据被完美地放置在观测时间窗口中，并记录了整个衰减曲线。不仅没有光子的损失，拟合时还具有更大的时间间隔，它可以很好地用于确定寿命值。因此，正确居中的衰减数据的寿命直方图明显变窄，见图17，底部。标准差 στ 为 80 ps，而左侧数据的标准差为 118 ps。这是一个1.48的比率，正确居中的衰减数据更佳。στ 中 1.48 的比率可能听起来不多，然而，它转化为光子效率是2.18倍。这意味着错误配置的系统需要2.18倍的光子数（或2.18倍的采集时间！），才能达到与右侧系统相同的寿命精度。
图17：衰减曲记录欠佳的影响。在左图中，衰减曲线被不正确地放置在观测时间窗口中，衰减曲线的远端没有记录。在右图中，衰减数据完美地放置在观测时间窗口中。记录整个衰减曲线。正确居中的衰减数据的寿命直方图明显更窄。
图 16 和图 17 中左右的寿命图像的比较也显示了另一个效果：
左侧图像中的寿命偏向于较小的值，原因是荧光衰减不是纯粹的单指数。慢衰减分量在衰减曲线的尾部最为突出，而它在丢失的部分数据中。当数据分析过程使用单指数模型拟合数据时，它只能优化衰减数据记录部分的拟合。在这一部分中，慢速分量的表示不足，结果是确定的寿命比实际时间短。采用一阶矩技术的情况更糟，由于缺少荧光衰减的尾部，计算的矩太小，因此从一阶矩得出的荧光寿命太小。
激光器重复频率
使用ps二极管激光器的FLIM系统可以在不同的激光重频下工作，参考文献[5，6，7]。标准重频为 20 MHz、50 MHz 和 80 MHz，其他重频也可按需定制。使用Ti：Sa激光器的多光子FLIM系统以80 MHz的频率运行，而采用飞秒光纤激光器的系统通常使用40 MHz，参考文献 [14]。哪种重频最好？5 ns的荧光寿命是否仍能以 80 MHz 的重频准确测定？我是否应该总是使用80 MHz，因为它有充足的激发功率？
图18显示了染料溶液扫描中选定点的衰减曲线，荧光寿命为5.6 ns。上部曲线以50 MHz获得，下部曲线以80 MHz重频获得，光子数约为20,000，在两条曲线中大致相同，但这两条曲线都包含大量来自上一个激发脉冲激发出的光子的“不完全衰减”。当然，在80 MHz的记录中，不完全衰减的量更高，因为荧光衰减的时间更短。显而易见，衰减不完全的数据不能用一阶矩技术来分析。它们可以使用SPCImage的“不完全衰减”模型进行处理，以这种方式处理图像会产生图18中右图所示的寿命分布。
图18：染料溶液的荧光衰减函数，5.6 ns荧光寿命。顶部：激光重复率 50 MHz。底部：激光重复率 80 MHz。左侧：衰减曲线。右侧：像素上寿命的直方图。
结果是令人意外的：尽管50-MHz曲线看起来更加“分析友好”，但直方图实际上是相同的。为什么？原因是5.6 ns衰减和另一个5.6 ns衰减的总和偏移了一个周期，仍然是5.6 ns衰减。因此，拟合程序以合理的标准偏差提供正确的寿命值。标准偏差大于20，000光子的理想值，但对于两个记录都是相同的。与理想记录相比的损失来自记录时间间隔不覆盖整个衰减的事实，而不是来自存在不完全衰减的事实。图 19 支持这一点，它显示50 MHz的记录，但在20 ns的观测时间间隔内，寿命分布明显更窄。
图19：5.6 ns的荧光衰减，以50 MHz的重频，记录在20 ns的观测时间间隔内。
所以结论是：如果可能的话，使用尽可能覆盖荧光衰减的记录时间窗口。如果因为激光脉冲周期太短而无法这样做，不要担心，数据分析将处理不完整的衰减，并提取最佳的寿命信息。
计数背景
计数背景不仅是FLIM数据中最常见的缺陷，也是最具破坏性的缺陷。幸运的是，这也是最容易避免的，在大多数情况下，背景只是来自日光的影响。最脆弱的是采用非解扫探测（NDD）的多光子系统，这些系统没有针孔可以阻挡来自激发点外部的光，它们直接探测样品散射出来的光子，从样品表面的大面积区域收集光，这样做的副作用是它们对环境光也很敏感。因此，必须使系统远离日光。
图20显示了如果衰减数据被背景计数覆盖会发生什么情况。荧光光子（a）的平均到达时间<t> = τ，时序噪声为σt = τ。我们可以单独建立荧光光子的光子分布，它将代表真正的荧光衰减曲线（a，右），以στ = τ / SQRT（N）的标准偏差提供荧光寿命，即光子效率为1。背景光子（b）在整个观测时间窗口（T）上均匀分布，它们的平均到达时间为T/2，时序噪声为σtbkg=0.28 T（见图24）。
记录过程在荧光和背景光子之间没有区别，因此，探测到的信号（c）是荧光衰减和背景的总和。这会导致两个不利影响：首先，平均到达时间不再是荧光衰减时间τ，相反，它是寿命τ和背景光子平均T/2的光子数加权平均值，因此，数据不能通过一阶矩或基于矩的任何其他技术进行分析。
其次，有效定时噪声是荧光光子的定时噪声σt = τ和背景的定时噪声σtbkd = 0.28 T的加权和。在大多数情况下，0.28 T 大于 τ，因此，它对净标准差（测量寿命的 στmeas）有很大的影响。精确计算στmeas以及光子效率是困难的，并且提供的结果不容易解释。上述讨论表明，计数背景对探测到的荧光寿命有很大影响。
图20：计数背景对光子时间的影响
一个实际示例如图 21 所示，来自同一样品的FLIM图像以带背景（左）和不带背景（右）记录。在左图中，每个像素中的背景约为900计数（所有时间通道的总和），在右图中接近于零，最亮像素中的荧光光子数量约为4000。因此，背景明显损害了图像的对比度，参见图21，左图。然而，对比度的损失并不是那么糟糕，但图像模糊了。右图没有背景，因此提供了最大的对比度。
所选点中的衰减曲线显示在第二行中，左图的衰减曲线包含背景计数，右图的衰减曲线不包含背景计数。背景似乎很温和，看起来不像是一个真正的问题，然而，对寿命准确性的影响是巨大的。这可以在图21的第三行中看到，它显示了每个记录的phasor plot图和按一阶矩计算的寿命直方图。可以很容易地看出，左侧数据组的直方图和phasor plot图不仅完全偏移，而且极度展宽。原因不仅在于背景为光子数据增加了时序噪声，还在于背景为矩增加了偏移。由于荧光信号和背景信号的比值随像素的亮度而变化，因此寿命值被极度模糊。
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图21：计数背景对FLIM精度的影响。左：带背景计数的 FLIM 数据。右：无背景记录。上行：图像。第二行：所选点中的衰减数据。第三行：M1 分析的Phasor plots图和寿命直方图。最下行：采用 MLE 分析的寿命直方图。
图21的底行显示了采用MLE分析获得的寿命直方图，就寿命移位而言，拟合过程比矩分析做得更好。寿命大约是170 ps，直方图比右边的无背景记录宽两倍，寿命标准偏差的两倍转化为光子效率是相差四倍！
时间通道数
与普遍的观点相反，衰减曲线中的时间通道数对信噪比没有直接影响。它没有出现在一阶矩分析推导的SNR方程（“信噪比”小节）中，并且拟合例程进行数据分析并不关心FLIM数据在两倍的时间通道中是否只有一半的光子数量，反之亦然。只有衰减曲线中的光子总数才重要，图22给出了实验验证。它显示了一个用Alexa 488染色的样品，在所使用的探测波长下，整个扫描区域的寿命几乎是均匀的。第一行中的数据用64个时间通道记录，第二行的数据用1024个时间通道记录，图像中的光子总数几乎相同。正如预期的那样，寿命直方图（第一行和第二行，右）几乎相同。
图22：使用不同数量的时间通道，相同的光子总数进行记录。上排：64 个时间通道。下排：1024个时间通道。从左到右：图像，光标位置的衰减曲线，单指数拟合，像素上寿命直方图。与普遍的观点相反，在64通道记录中，每个时间通道的光子数量越多，并没表现出更高的寿命精度。
寿命的SNR与时间通道数无关，这并不意味着可以使用数量任意小的时间通道和任意大的时间通道宽度。在两个或四个时间通道中进行探测会大大降低光子效率，参考文献[1，10，16]。当时间通道宽度与IRF宽度的数量级相同时，SNR已经开始下降。这种情况下，不清楚IRF在第一个通道中的位置，以及荧光脉冲的上升开始的位置。这增加了寿命计算的不确定性。根据经验，IRF和最快的衰减分量都应使用不少于5至10个时间通道进行采样。这意味着，对于HPM-100-40探测器（IRF宽度120 ps），探测低至100 ps的快速衰减分量，时间通道宽度应约为10 ps。对于 10 ns 的观测时间间隔，时间通道数应为 1024。对于 HPM-100-06（IRF 宽度<20 ps），将时间通道数增加到 4096（即将时间通道宽度减小到3 ps）是合理的，如果要探测超快衰减分量，采用更窄的时间通道更佳。
IRF——仪器响应函数的影响
如果 FLIM 系统的 IRF 具有非零宽度，会发生什么情况？IRF的影响可以通过观察光子到达时间来估计。让我们假设我们已经记录或以其他方式确定了FLIM系统的IRF，然后，我们可以通过平均IRF测量的光子时间来定义IRF的“质心<tirf>。如图6所示，荧光衰减时间τ是通过简单地从平均光子时间<t>中减去<tirf>而获得的，参见图23，左图。
图 23：IRF 宽度不为零的系统中寿命测量的标准偏差。左图：寿命是光子的平均到达时间 t 减去 IRF 质心的时间，<tirf>。右图：测量寿命的标准差 τmeas 包含 IRF σirf 的贡献。
以这种方式获得的寿命标准偏差是多少？可以假设标准差仍然是τ / SQRT（N）：IRF的质心是准确的，减去它不会改变t的标准差，但这是不可能的，因为光子时间本身包含来自IRF的不确定性，每个荧光光子定时参考在IRF中都是不同时间。另外，它可能在激光脉冲的不同时间被激发，或者它花了不同的时间通过探测器，这增加了光子时间t的不确定性，并增加了IRF σirf对理想光子时间的标准偏差σt = τ的贡献。
因此，测量光子乘以σtmeas的标准差大于τ，测量寿命的标准偏差στmeas大于τ / SQRT（N），可以通过下式来进行估算：
στmeas = SQRT (τ2 + σ2irf) / SQRT (N)
或
σirf也被称为“计时抖动的RMS值”或 （有点误导地）“IRF宽度的RMS值”。对于在实践中遇到的IRF形状，它大约是IRF半高宽（FWHM）最大值的0.43到0.87。图 24 给出了几种典型 IRF 形状的 RMS 与 FWHM 值。对于高斯IRF，计时抖动的RMS值为0.43 FWHM。对于非对称函数，这个值会更大。具有慢尾或带有凸起的IRF会给衰减数据增加更多的时序噪声，如果可能的话，应该避免使用。请注意，尾部和凸起也可能源于过高功率下工作的皮秒二极管激光器。不利的IRF形状造成的精度损失实际上可能超过光子数量增加带来的增益。
图 24：一些典型 IRF 形状的 RMS 值。从左到右：矩形、高斯、x⋅e-x、有凸起的x⋅e-x、指数函数 e-x 。函数归一化为相同的FWHM，RMS值以FWHM的倍数给出。
从这个结果中可以得出两个结论。第一个是，毫不奇怪，SNR仍然与N的平方根一起缩放。第二个是，只有当IRF宽度的RMS大于荧光寿命的约50%至100%时，SNR才会大幅下降。随着IRF宽度的增加，寿命精度的下降缓慢。这导致了一种误解，即FLIM系统的IRF宽度并不重要：典型荧光团的荧光寿命在几纳秒的范围内，因此，如果 IRF 是完全已知的，则 500 ps 到 1 ns（RMS） 的 IRF 宽度应该就足够了。然而，这与任何实际经验相矛盾，错误出在哪里？
FLIM中的荧光衰减函数不是单指数的，不仅如此，所需的信息通常是在衰减函数的组成中，而不是在净“寿命”中。在这种情况下，IRF必须比最快的衰减分量快。FRET测量和自发荧光测量中的主要衰减成分分别低至约300 ps和100 ps，参考文献[2]，HPM-100-40 探测器非常适合这些应用。在蘑菇孢子，参考文献[12]，人类头发和哺乳动物皮肤病变中，会遇到低至10 ps范围的寿命。这些测量需要更快的探测器。示例将显示在“多指数衰减函数”一节中。
多指数衰减函数
当FLIM仅用作激光扫描显微镜中的比对技术时，荧光衰减的单指数近似值及其表观寿命的测量可能就足够了。然而，FLIM的真正应用是分子成像。荧光团 – 无论是内源性还是外源性 – 根据其分子环境改变其荧光寿命。这可能与蛋白质，蛋白质结构，蛋白质与其他蛋白质的相互作用，细胞或组织代谢状态的影响，或参与细胞功能的离子浓度相结合。在这些应用中，任务不是区分不同的荧光团，而是区分不同分子环境中相同荧光团的组分，并通过其相对浓度量化它们，参考文献[1，4，15]。在大多数情况下，这需要记录多指数衰减函数，并将它们分成不同的衰减分量。因此，多指数衰减记录和多指数衰减分析是生物系统的FLIM标准配置。图 25 和图 26 显示了几个示例。图30、图31和图38显示了多指数FLIM测量的更多示例。
图25：顶部：人体视网膜的FLIM图像，在体记录。快速、中衰减和慢衰减分量的强度贡献。底部：图像选定点的衰减曲线。数据由耶拿大学的Dietrich Schweitzer和Martin Hammer提供。
图26：通过FLIM对NADH（左）和FAD（右）进行代谢成像。双指数衰减的振幅加权寿命（tm）、和快速衰减分量振幅a1的图像。底部：NADH和FAD图像的选定点中的衰减函数。
从多指数衰减分析中提取单个衰减分量比单指数拟合或一阶矩分析需要更多的光子，参考文献[17]。因此，探测效率和光子效率是关键参数。时间分辨率也很重要 – 对IRF宽度的要求是由最快衰减分量的寿命决定的，而不是由净衰减函数的表观寿命决定的。
同样重要的是衰减函数的形状，它们与单指数衰减的差异越大越好。具有几乎相同寿命的衰减分量很难或不可能分裂，参考文献[17]，低振幅的衰减分量也很难提取。图 27 显示了三个示例。左图所示的函数在 2.4 ns 的背景中包含 445 ns 的 82 %。这很容易解决。中间的函数比较困难。快速分量的幅度仅为24%，寿命值接近900 ps，而慢速分量的幅度为2.5 ns。净衰减函数比左边的函数更接近单指数。右侧的衰减轮廓在视觉上与单指数衰减无法区分。它包含35%的3 ns和65%的4.5 ns，使用FLIM中通常可用的光子数量，无法逐个像素地解析。
图 27：双指数衰减函数。左侧的函数易于解析，中间的函数难以解析，右侧的函数在FLIM数据中几乎不可能解析。
图27右所示的情况，如果可能的话，应该在实验计划中避免。一个例子是FRET实验：具有大供体 – 受体重叠的FRET对，和具有短供体 – 受体距离和大比例供体相互作用的FRET结构，以大振幅和短寿命提供供体衰减函数的快速分量。这使得衰减轮廓更容易分辨，从而分离相互作用和非相互作用的供体部分。在某些情况下，如果信号利用光谱进一步分离，结果可以得到极大的改善。衰减分量的数量得以减少，分析变得更加容易。光谱分离可以在激发端和探测端获得。一个例子是NADH / FAD FLIM的代谢成像。当两个荧光团以相同的波长激发（正如经常尝试的那样）并且仅通过不同的发射滤光片观察到时，这种情况几乎是无望的。然而，通过在正确的波长间隔内进行多路复用激发和探测，信号可以很好地分离，参考文献[15]。因此，在样品设计和FLIM配置方面进行实验规划对结果的质量有很大的影响。
图28和图29给出了多指数衰减测量的示例。图28显示了NADH溶液的FLIM数据。使用溶液获得在整个扫描区域均匀的寿命分布。然后，像素上的参数直方图由光子噪声决定，而不是由扫描区域的寿命变化决定。在785 nm处用双光子激发记录数据，用512 x 512像素，1024个时间通道扫描图像。从上到下，图28显示了使用H7422-40 PMT探测器以及HPM-100-40和HPM-100-06混合探测器记录的数据。IRF 宽度分别为 250 ps、110 ps 和 18 ps。从左到右，该图显示了任意选定点的衰减曲线、快速分量 t1 的寿命直方图、第二快分量 t2 的直方图和慢分量 t3 的直方图。
可以清楚地看到，随着IRF宽度的减小，寿命直方图变得更窄。有趣的是，这不仅适用于快速分量，也适用于中慢分量。使用 HPM-100-06 获得最佳结果，即 IRF 宽度为 18 ps。使用如此快速的IRF记录的衰减数据几乎不受IRF引起的计时抖动的影响。HPM-100-06的t1、t2 和 t3 的直方图比 H7422 窄 1.4 倍，这意味着它的光子效率高出2倍。
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图28：NADH溶液，用不同探测器记录的数据。上排：H7422-40探测器，IRF宽度250 ps。第二排：HPM-100-40，IRF 宽度 110 ps。下排：HPM-100-06，IRF 宽度 18 ps。从左到右：任意选定点的衰减曲线，快速分量的直方图，t1，第二快分量的直方图，t2，慢分量的直方图，t3。双光子激发，非解扫描探测，图像512×512像素，1024个时间通道，约5000个光子在合并区域里。
图29给出了对寿命低于25ps的超快衰减分量探测的示例。这种快速分量很常见，我们经常在人类的头发，蘑菇孢子和哺乳动物皮肤的痣中发现它们。在黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的荧光衰减中也存在一种快速分量，FAD是一种存在于每个细胞中的天然荧光团。FAD很重要，因为它的荧光衰减函数包含有关细胞代谢状态的信息。
图29显示了FAD溶液的FLIM图像。从左到右，该图显示了快速衰减分量 t1、三重指数拟合的衰减曲线和 t1 直方图的图像。上行的数据用HPM-100-40探测器记录，下排的数据用HPM-100-06记录。从视觉上看，HPM-100-40（IRF 110 ps FWHM）记录的衰减曲线没有显示出快速分量的痕迹。但是，仔细的数据分析会提取一个使用寿命约为20 ps的分量。除非明确搜索，否则不易发现。整个图像上 t1 值的直方图显示在右侧。
用HPM-100-06（IRF宽度18 ps FWHM）记录的数据。衰减曲线令人信服地表明，快速分量确实存在。在图像的选定位置进行数据分析，最快的分量的寿命为16.5 ps（其他两个分量分别为2.2 ns和3.2 ns）。直方图显示最常见的 t1 值约为 16 ps。
正如对快速IRF所预期的那样，直方图比HPM-100-40的数据窄了近2倍。
图29：FAD溶液的荧光。从左到右：快速衰减分量t1的图像，三重指数分析的衰减曲线，t1的直方图。上排：用 HPM-100-40 探测器记录，IRF 宽度 110 ps FWHM。下排：使用 HPM-100-06 探测，IRF 宽度 18 ps FWHM。
IRF 宽度 vs 探测器效率
应该注意的是，探测器的IRF宽度与探测效率之间存在潜在的取舍。快速探测器具有传统的双碱光阴极，因此，它们的灵敏度比GaAsP探测器低约4倍，但没法知道更快的IRF和更高的灵敏度谁更重要。当然，为了解析超快衰减分量，没有办法绕过快速IRF，无论您是实际看到快速分量还是必须通过反卷积将其从数据中挤出。我们还发现，使用低于20ps的IRF对NADH和FAD数据的双指数和三指数衰减分析更可靠，参考文献[2，13]，这也可以在图28的底部看到。在实践中，探测器的选择取决于样品的光稳定性。如果样品在四倍的激发功率下或四倍的采集时间内依然保持稳定，则选择快速IRF的探测器。反之，则必须使用GaAsP探测器。
References
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